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Olavius algarvensis im Rampenlicht
Aufbau und Funktion eines Konfokalmikroskops
Spricht man vom Mikroskopieren, erinnert man sich meist an die ersten Schulversuche am Lichtmikroskop. Dünnschnitte von Zwiebelhäutchen, Speichelproben oder Tümpelwasser mussten herhalten. Manche machten trotz akribischer Einweisung Erfahrung mit dem knackenden Geräusch eines zersplitternden Deckgläschens.
Grundsätzlich werden jedoch durch Lichtmikroskope stark vergrößerte Bilder von Objekten geschaffen, die für unser Auge nicht mehr sichtbar sind. Dabei ermöglicht das Objektiv die erste Vergrößerung des Objektes und erzeugt ein Zwischenbild. Danach kommt das Okular, durch welches man das Zwischenbild wie durch eine Lupe betrachtet (zweite Vergrößerung). Die Gesamtvergrößerung berechnet sich hierbei durch die Multiplikation der ersten und zweiten Vergrößerungsstufe. Das Objekt liegt in einem gläsernen Objektträger auf dem Objekttisch und wird durch eine darunter befindliche Lichtquelle ausgeleuchtet. Durch senkrechtes Verschieben des Objekttisches kann das Bild scharf gestellt werden. Der erzielbaren Auflösung sind hierbei physikalische Grenzen gesetzt.
Im Gegensatz dazu wird beim Konfokalmikroskop nur ein winziger Bereich des Objektes beleuchtet und mit einem Laser im Rasterverfahren abgetastet. Hierbei wird das Präparat nur noch selten bewegt. Bietet dieses Messprinzip nun eine weitaus höhere Auflösung? Nein, denn die Auflösung eines Konfokalmikroskops unterliegt den gleichen physikalischen Gesetzen. Der Grund ein Konfokalmikroskop zu nutzen, ist das Ausblenden von Streulicht bei „dickeren“ Objekten. Doch gehen wir Schritt für Schritt vor.
Was heißt eigentlich konfokal?
Gemäß Wörterbuch wird es für den Physikbereich mit „den gleichen Fokus haben“ übersetzt. In der Wissenschaft wird die Kurzform CLSM für diese Mikroskoptechnik verwendet. Die Abkürzung steht im Englischen für „confocal laser scanning microscope“ und bedeutet nichts anderes als konfokales Laser-Scanning-Mikroskop oder auch konfokales Laser-Rastermikroskop. Vereinfacht kann man von einem speziellem Lichtmikroskop, welches mit Lasertechnik arbeitet, sprechen.
Im Wesentlichen setzt sich das CLSM aus fünf unterschiedlichen Bestandteilen zusammen.
Einer davon sind die Laser. Jeder für sich betrachtet wird als Lichtquelle genutzt. Das Besondere an ihnen ist aber die Eigenschaft, reines Licht einer Wellenlänge zu erzeugen. Der Scankopf oder auch Scanhead, welcher als rechteckige Box eher unscheinbar wirkt, ist nicht nur ein weiterer Bestandteil, sondern das „zentrale Bauteil“ des CLSM und setzt sich ebenfalls aus verschiedenen Komponenten zusammen. Hierzu gehören: das Scan-System, der Strahlteiler und das Pinhole.
Das Scan-System besteht aus zwei beweglichen Spiegeln, welche ermöglichen, dass der Laser in einem bestimmten Muster das Objekt abfährt. Hinter dem Strahlteiler verbergen sich ein dichroitischer Spiegel (ein Bauelement, welches Wellenlängen auswählt), Blenden bzw. Beugungsgitter und ein Sperrfilter. Die Strahlung erfolgt nicht durch den Sperrfilter, sondern variabel durch Beugungsgitter und dichroitische Spiegel. Das „ausgefilterte“ Licht kann folglich weiter gesiebt und aufgeteilt werden. Es gibt durchaus Strahlteiler, welche das Anregungslicht, also den Laser, zum Objekt spiegeln und gleichzeitig die längerwellige Fluoreszenz in Richtung Detektor durchlassen. In diesem Fall sitzt vor der Detektion ein zusätzlicher Sperrfilter, welcher nur die Fluoreszenz durchlässt und zurückgestreutes Laserlicht zurückhält.
Das ist ja noch einigermaßen nachvollziehbar. Doch was verbirgt sich hinter dem Begriff Pinhole?
Zunächst einmal eine konfokale Blende, genauer gesagt eine Lochblende, welche in der hinteren Brennebene und vor dem Detektor liegt. Sie ist in der Größe stufenlos verstellbar. Ihre Aufgabe liegt in der Regelung des Streulichtes, das heißt sie bestimmt, wie viel gestreutes Licht unterbunden wird und wie viel Licht auf den Detektor gelangt. Daraus kann man schlussfolgern: Je kleiner das Pinhole, um so kleiner die Schichtdicke, aus der Licht den Detektor trifft. Idealerweise wird das Pinhole so eingestellt, dass sich genau die Schichtdicke ergibt, in welcher gerade noch alles scharf im Fokus abgebildet ist. Feine Details werden sichtbar, da jetzt das Bild von keinem störenden Streulicht mehr überlagert wird, welches es verschwommen aussehen lassen würde.
Also doch eine bessere Auflösung?
Nicht wirklich, denn diese wäre bei normaler Lichtmikroskopie genauso gegeben, wenn das „verschwommene“ Streulicht nicht wäre. Hierbei nimmt aber auch die Helligkeit stark ab.
Bleiben noch drei wesentliche Bestandteile des CLSM übrig. Da wäre zunächst das Fluoreszenzmikroskop.
(© Max-Planck-Institut für Marine Mikrobiologie / J. Schneider)
Nanu, wie funktioniert denn das?
Das zu untersuchende Präparat wird vorbereitet, so dass es bei Bestrahlung mit einem Laser Licht anderer Wellenlängen emittiert. Es „fluoresziert“. Dieses Licht wird nun durch Linsen und Filter im Mikroskop so verarbeitet, dass es an die weiteren Bauteile übergeben werden kann.
Ebenso wichtig ist der vierte Bestandteil, nämlich der im oberen Text bereits erwähnte Detektor, welcher die Elektronen, die durch das Objekt hindurchgehen, misst. So genannte „Photomultiplier (PMTs)“ werden beim CLSM zum Sammeln und Verstärken der einfallenden Elektronen und Photonen eingesetzt. Sie reagieren sehr schnell und besonders empfindlich auf das einfallende Licht. Zu guter Letzt darf der Computer als fünfter Bestandteil nicht unerwähnt bleiben, da er die gesammelten Daten zusammenführt.
Nachdem nun die wesentlichen Komponenten bekannt sind, gilt es diese zu ordnen, so dass sich eine nachvollziehbare Funktionsweise ergibt.
Was passiert dann?
Zunächst wird das Laserlicht in bestimmter Weise auf das Objekt fokussiert. Dies ist über einen Scanner und durch die Linsen eines Objektivs möglich. Im Folgenden gelangt Reflexions- bzw. Emissionslicht, welches aus der Fokusebene und aus den naheliegenden Ebenen kommt, über den Scanner zu einem Strahlteiler. Hier wird es aus dem Laserstrahlengang ausgekoppelt, sprich herausgeleitet. Dieses Licht wird sodann auf einer sehr kleinen Blende, Pinhole genannt, fokussiert. Ist das Pinhole entsprechend eingestellt, kann nur das Licht aus der Fokusebene die Blende passieren, während Licht aus anderen Ebenen des Objektes zurückgehalten bzw. unterdrückt wird.
So weit so gut. Fehlt noch die Fluoreszenz. Sobald fluoreszierende Stoffe durch Licht bestimmter Wellenlängen angeregt werden, strahlen diese Licht längerer Wellen ab. Bei der Fluoreszenzmikroskopie wird das Bild nur durch emittiertes Licht erzeugt. Hier werden Laser eingesetzt, denn von anderen Lichtquellen geht kein ausreichend intensiver Lichtstrahl aus, der den Prozess in Gang bringt. Schlussendlich kann durch die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen und unterschiedlichen Wellenlängen des „Beobachtungslasers“ die räumliche Verteilung von markierten Stellen des Objektes dokumentiert werden.
Puuh, dass waren eine Menge Informationen! Grundlegend passiert aber erst einmal Folgendes: Das reflektierende Licht wird von einem Detektor erfasst. Daraufhin wandert der Strahl über eine bestimmte Ebene des Objektes. Die Lochblende (Pinhole) sorgt in der Zeit dafür, dass Licht außerhalb dieser Ebene ausgeblendet wird. So können durch schrittweise Fokussierung auf unterschiedliche Ebenen Einzelbilder erstellt werden und diese später am Computer zur 3D- Konstruktion zusammengeführt werden.
Somit ergänzt das spezielle Konfokalmikroskop das klassische Lichtmikroskop, da es nicht nur ein klareres Bild mit mehr sichtbaren Details schafft, sondern auch in der dritten Dimension gearbeitet werden kann.