Durchfluss-Zytometrie

Durchfluss-Zytometer (© Max-Planck-Institut für Marine Mikrobiologie, K. Matthes)
Das Durchfluss-Zytometer BD Influx Mariner (© Max-Planck-Institut für Marine Mikrobiologie, K. Matthes)

Was ist Durchfluss-Zytometrie?

Durchflusszytometrie erlaubt das Messen verschiedener Eigenschaften einzelner Zellen in einem Wasserstrahl. Am Max-Planck-Institut für Marine Mikrobiologie nut­zen wir die Durch­fluss­zy­to­me­trie einerseits, um die Anzahl von Zellen in See­was­ser­pro­ben und in Zell­kul­tu­ren festzustellen. Andererseits können wir mit der Technik Zellen mit hoher Geschwindigkeit und in hoher Reinheit gemäß ihrer Eigenschaften sortieren, um sie im Anschluss weiter molekularbiologisch zu analysieren.

Für die mo­le­ku­lar­bio­lo­gi­sche For­schung stellt die Durch­fluss­zy­to­me­trie eine wich­ti­ge Er­gän­zung dar. Die Möglichkeit, Tau­sen­de von Zel­len pro Se­kun­de zu ana­ly­sie­ren und gleich­zei­tig mul­ti­ple Pa­ra­me­ter wie die Fluoreszenz von Photosynthesepigmenten oder spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen auf­zu­neh­men, macht die Durch­fluss­zy­to­me­trie zu ei­nem Stan­dard­werk­zeug in der Plank­ton­for­schung. Zu­sätz­lich lässt das durch­fluss­zy­to­me­tri­sche Sortieren eine phy­si­ka­li­sche Tren­nung und kul­ti­vie­rungs­un­ab­hän­gi­ge An­rei­che­rung von wohl­de­fi­nier­ten Zell­po­pu­la­tio­nen zu.

Die Durchflusszytometrie ist am Max-Planck-Institut für Marine Mikrobiologie eine eigene Arbeitsgruppe. Dort ver­bes­sern wir stän­dig un­se­re durch­fluss­zy­to­me­tri­schen Me­tho­den und ver­knüp­fen sie mit neu­en mo­le­ku­lar­bio­lo­gi­schen An­sät­zen, um tie­fe­re Ein­bli­cke in die je­wei­li­ge öko­lo­gi­sche Rol­le von Mi­kro­or­ga­nis­men in ver­schie­de­nen ma­ri­nen Ha­bi­ta­ten zu ge­win­nen.

Wie funktioniert die Durchfluss-Zytometrie?

Durchfluss-Zytometrie (Max-Planck-Institut für Marine Mikrobiologie, B. Fuchs)
Prinzip der durchflusszytometrischen Analyse und Sortierung
(© B. Fuchs, Max-Planck-Institut für Marine Mikrobiologie)

Bei der Durchflusszytometrie wird die Pro­be mit den Zel­len in die Mitte eines kontinuierlich fließenden Wasserstrahls (auch Hüllflüssigkeit genannt) in­ji­ziert. Im weiteren Verlauf wird der Wasserstrahl mittels einer Düse auf einen Durchmesser von weniger als 1/10 Millimeter verjüngt. Die eingeschlossenen Zellen wer­den dadurch in die Mit­te des Was­ser­strahls fo­kus­siert und ver­las­sen die Düse wie Per­len auf ei­ner Schnur. Die exakt ausgerichteten Zel­len passieren den La­ser­strahl einzeln im Beobachtungspunkt und können so vom Laserlicht angeregt werden. Je nach Größe und Färbung der Zelle werden die Lichtsignale der Zel­len durch Lin­sen (nicht ab­ge­bil­det) auf die De­tek­to­ren fo­kus­siert, dort in elektrische Signale umgewandelt und weiter in eine Soft­ware am Rech­ner ein­ge­spielt.

Im Sortiermodus können die Zellen zudem nach bestimmten Ei­gen­schaf­ten ge­trennt wer­den. Da­für le­gen die For­schen­den Be­din­gun­gen fest, die die Zel­len er­fül­len müs­sen. Die Düse schwingt in hochfrequenten Schwingungen, was dazu führt, dass der Wasserstrahl unterhalb des Beobachtungspunktes zu definierten Tröpfchen abreißt. Falls eine Zelle detektiert wird, die die vorgegebenen Parameter erfüllt, wird die ent­spre­chen­de Zel­le mit ih­rem Tröpf­chen elek­trisch ge­la­den. Die ge­la­de­nen Tröpf­chen mit den Zel­len wer­den ge­mäß ih­rer La­dung (po­si­tiv oder ne­ga­tiv) ab­ge­lenkt und lan­den in ei­nem Re­ak­ti­ons­ge­fäß. Ab­ge­bil­det ist hier ein Zwei-Wege-Sor­ter, der zwei Po­pu­la­tio­nen gleich­zei­tig sor­tie­ren kann.

Wir ha­ben am In­sti­tut ak­tu­ell drei ver­schie­de­ne Durch­fluss­zy­to­m­e­ter. Sie un­ter­schei­den sich un­ter an­de­rem in Grö­ße, Sen­si­bi­li­tät und Aus­stat­tung. Alle drei kön­nen trans­por­tiert wer­den und sind für den Ein­satz an Bord von For­schungs­schif­fen ge­eig­net. Wei­te­re In­for­ma­tio­nen gibt es auf der Ab­tei­lungs­sei­te der Forschungsgruppe Durchflusszytometrie.

Die Durchfluss-Zytometrie im Einsatz

Wir kombinieren mehrere Methoden zur spezifischen Anreicherung von Bakterien: (1) Wir färben mit FISH eine bestimmte Bakterienart aus unserer Helgoland-Wasserprobe an. (2) Anhand dieses Signals werden nur hybridisierte (=leuchtende) Zellen mit dem Durchflusszytometer aussortiert. (3) Die DNA dieser Anreicherung wird dann sequenziert und weiter analysiert. (© Max-Planck-Institut für Marine Mikrobiologie, A. Grieb)
Wir kombinieren mehrere Methoden zur spezifischen Anreicherung von Bakterien: (1) Wir färben mit FISH eine bestimmte Bakterienart aus unserer Helgoland-Wasserprobe an. (2) Anhand dieses Signals werden nur hybridisierte (=leuchtende) Zellen mit dem Durchflusszytometer aussortiert. (3) Die DNA dieser Anreicherung wird dann sequenziert und weiter analysiert. (© Max-Planck-Institut für Marine Mikrobiologie, A. Grieb)

Analyse unbekannter Mikroben vereinfacht

Marine Mikroben mögen es, verstecken zu spielen. So tauchen manche Bakterien immer wieder in Proben auf, wollen aber im Labor einfach nicht wachsen. Gleichzeitig sind es in den Umweltproben jeweils zu wenige, um ihre Identität über eine Gen-Analyse zu enthüllen.

Die Lösungs-Idee: Mit einem Durch­fluss­zy­to­m­e­ter die Zel­len der in­ter­es­sie­ren­den Spe­zi­es vor dem Se­quen­zie­ren der DNA aus­sor­tie­ren. So wird die Di­ver­si­tät ge­rin­ger und die ei­gent­lich nicht so häu­fi­ge Spe­zi­es kann sich nicht mehr so gut ver­ste­cken. Die Wis­sen­schaft­le­rin­nen und Wis­sen­schaft­ler mar­kier­ten also mit der FISH-Me­tho­de DNA-Ab­schnit­te der Mi­kro­ben mit fluo­res­zie­ren­den Farb­stof­fen. So kön­nen sie die Bak­te­ri­en er­ken­nen und aus­sor­tie­ren. Al­ler­dings gibt es da­bei zwei Her­aus­for­de­run­gen: Ers­tens muss das Farb­si­gnal sehr stark sein, da­mit die Zel­len wäh­rend des Sor­tie­rens gut zu fin­den sind. Zwei­tens darf aber die DNA durch den Farb­stoff nicht be­ein­träch­tigt wer­den, da sie für eine qua­li­ta­tiv hoch­wer­ti­ge Ge­nom-Ana­ly­se im An­schluss mög­lichst in­takt sein muss.   

Ge­mein­sam mit For­schen­den des Joint Ge­no­me In­sti­tu­te tes­te­te ein Team um Anis­sa Grieb, wie die­ser Ba­lan­ce­akt ge­lin­gen kann. Er­folg hat­ten sie am Ende mit ei­ner kürz­lich ent­wi­ckel­ten Va­ri­an­te der FISH-Me­tho­de, und zwar mit der Hy­bri­di­sie­rungs-Ket­ten­re­ak­ti­on (HCR-FISH), die sie durch An­pas­sung ver­schie­de­ner Pa­ra­me­ter wie der Tem­pe­ra­tur für ihre Zwe­cke op­ti­mier­ten. Zu­nächst ha­ben sie die­se Vor­ge­hens­wei­se mit Rein­kul­tu­ren im La­bor op­ti­miert und an­schlie­ßend er­folg­reich mit den Um­welt­pro­ben ge­tes­tet, die vor Hel­go­land ge­nom­men wur­den.

 

  • Das Paper zum Thema ist hier erhältlich: Grieb A, Bower RM, Oggerin M, Goudeau D, Lee J, Malmstrom RR, Woyke T, Fuchs BM. 2020. A pipeline for targeted metagenomics of environmental bacteria. Microbiome 8:21 https://doi.org/10.1186/s40168-020-0790-7

 

 

Wer nutzt die Durchfluss-Zytometrie?

Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler der Abteilung Molekulare Ökologie. Sie steht aber auch anderen Forschenden des Instituts offen sowie externen Forschenden im Rahmen von Kooperationsprojekten.

Kontakt

Gruppenleiter 

Forschungsgruppe Durchflusszytometrie

PD Dr. Bernhard Fuchs

MPI für Marine Mikrobiologie
Celsiusstr. 1
D-28359 Bremen

Raum: 

2222

Telefon: 

+49 421 2028-9350

PD Dr. Bernhard Fuchs
 
 
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